Sono stati esaminati mediante test citotossico 124 soggetti che presentavano sintomatologie multiple e/o croniche. I risultati del test sono stati usati per formulare un regime alimentare con la esclusione degli alimenti intolleranti. Si dimostra che tutti i pazienti studiati hanno avuto miglioramento o scomparsa dei sintomi.

Introduzione
Le allergie e le intolleranze sono espressione della risposta dell'organismo all'esposizione ad un allergene. Le modalità di approccio culturale, diagnostico e terapeutico per ciascuna di queste reazioni variano in modo sostanziale. Si definisce allergia alimentare una reazione IgE mediata, che compare da immediatamente ad alcune ore dopo l'assunzione dell'alimento causale sostenuta da un meccanismo immunologico. Il controllo della produzione di anticorpi IgE specifici e geneticamente determinato dai geni della risposta immune della regione HLA-D. (Bach, 1985; Korman, 1985; Unante, 1987). (Schema 1). L'intolleranza e una reazione infiammatoria dipendente dal progressivo accumulo di sostanze con effetto infiammatorio nell'organismo. Il meccanismo di reazione e probabilmente dovuto ad alterazioni del sistema immunitario con coinvolgimento dei granulociti neutrofili, IgG 4 e interleukina causate dalla reazione contro sostanze riconosciute come dannose. I disturbi non sono in relazione diretta all'assunzione dell'alimento ma si possono verificare a distanza di tempo e i sintomi e le malattie possono interessare qualunque organo/apparato.

Cenni di storia
Intorno al 400 a.c. Ippocrate, nei suoi insegnamenti, spiegava l'importanza della alimentazione con queste parole "che l'alimento sia la tua medicina e la medicina sia il tuo alimento".
Bisognerà arrivare all'800 e al 900 perchè questo concetto di relazione tra cibo e salute ricompaia nella medicina, soprattutto nell'area anglosassone.
Nel 1905 Hare F.W. nel suo lavoro "The Food factor in disease" sostiene l'ipotesi che molte malattie potevano essere causate dalla presenza di intolleranze alimentari. A seguire nel 1925 Duke W.W. pubblico casistiche su casi di asma e riniti causate da intolleranze alimentari, e sempre nel 1925 G. Piness e H. Miller editarono i loro studi su casistiche pediatriche legate alle intolleranze alimentari.
Fu con A. Rowe nel 1931 e successivamente con T. G. Randolph nel 1951 che viene ipotizzata l'eziopatogenesi alimentare di molte patologie croniche. Rowe provo che molte patologie, quali asma, insufficienza respiratoria ostruttiva, colite ulcerosa, mal di test erano causate da allergie al cibo.
L'idea guida di Randolph era, invece, quella di evidenziare come, oltre ai classici fenomeni allergici immuno-mediati, esistessero una serie di situazioni di "intolleranza" che si manifestavano con delle vere e proprie assuefazioni a sostanze come gli alimenti.
Fu nel 1993 che la Accademia Americana di Allergologia (AAAA) classifica le reazioni avverse ai cibi come:

1. reazioni allergiche propriamente dette dovute a meccanismi immunologici e dose-indipendenti (mediate dalle IgE ed IgG).
   
2. pseudoallergie da deficit enzimatici (es. deficit di lattasi con intolleranza al latte, favismo).
   
3. reazioni pseudoallergiche dovute a meccanismi extraimmunologici e dose-dipendenti (farmaci e alimenti liberatori di istamina)
   
4. reazioni tossiche agli alimenti, ossia avvelenamento da funghi, da botulino.
5. intolleranze, in cui eliminando completamente un alimento, si verifica la scomparsa del sintomo.

Nel 1956 A. Black riuscì a mostrare una correlazione tra le modificazioni della struttura dei leucociti e le reazioni allergiche e, continuando su questa strada nel 1959 il prof. B. Waksman, immunologo, pubblico studi sugli effetti tossici delle reazioni antigene-anticorpo sulle cellule.
Nel 1960 Bryan e Bryan codificarono una metodica per la identificazione delle intolleranze alimentari che si basava proprio sulla reazione tossica cellulare a livello dei leucociti. Nel 1984 e stata importata in Europa dagli USA la metodica codificata di un test citotossico, che valutava cioè in modo oggettivo le alterazioni a livello dei leucociti messi a contatto con allergeni specifici alimentari, fornendoci cosi di uno strumento diagnostico nuovo.

Scopo della ricerca
Lo studio e stato pianificato in modo da cercare di verificare l'utilità di un test citotossico per la risoluzione di diverse sintomatologie di natura generale e, più specificamente dermatologiche.

Materiali e metodi
Il principio del metodo del test citotossico si basa sulla messa a contatto dei leucociti del paziente per verificarne la eventuale reattività contro allergeni alimentari. Tale reattività si manifesta con lesioni di varia entità sulla struttura dei leucociti.
Nel nostro lavoro gli estratti alimentari sono stati forniti dalla Allergon AB, svedese, una azienda del gruppo Pfeizer che ci garantiva allergeni estratti con metodo industriale, ripetibile e grandi lotti di produzione, quindi con una variabilità di produzione sufficientemente ridotta.
Gli allergeni sono fissati su vetrini portaoggetti e commercializzati in confezione. La preparazione dei kit in commercio può essere cosi descritte

1. Vetrini porta oggetto: i vetrini sono acquistati in commercio già sgrassati e lavati garantiti dalla ditta produttrice
   
2. Stampa dei vetrini: vengono stampati i cerchietti numerati con inchiostro indelebile sui vetrini portaoggetto (grandezza dei cerchietti 0,7 cm di diametro). Vengono anche stampati i cerchietti dei controlli negativi. Per la stampa dei cerchietti e utilizzato inchiostro indelebile che permette di non creare spessori sul vetrino porta oggetto, come possono fare ad esempio la paraffina o altre sostanze, le quali possono impedire l'appoggio perfetto del vetrino coprioggetto sulla microgoccia di sangue da analizzare. L'adesione non perfetta del vetrino coprioggetto sul campo di lettura comporta sicuramente una visione microscopica meno precisa che potrebbe portare ad una inesatta interpretazione del test.
   
3. Deposizione del reagente alimentari: viene deposto sul vetrino il reagente alimentare o chimico per ADESIONE DIRETTA, cioè senza intermediazione di catalizzatori o di altre sostanze chimiche sul vetrino che potrebbero interferire sulla reazione cellulare e quindi sull'esito della risposta al microscopio.
   
4. Asciugatura: l'asciugatura-essiccazione dell'allergene sul vetrino e effettuata in una camera termica a 30° C
   
5. Confezionamento: i vetrini sono posti in scatoline, alloggiati in appositi scompartimenti e sigillati. Sono quindi applicate la data di produzione e la scadenza.

1. Due o tre provette contenenti sodio citrato come anticoagulante ( 0,4 ml Na citrato). Ogni provetta dovrà essere riempita con circa 4 ml di sangue
2. Pipette Pasteur monouso
3. Micropipette tipo Eppendorf Provette da sierologia
4. Vetrini coprioggetto 18x18
5. Pannello test
6. Centrifuga
7. Microscopio ottico con ingrandimento 40x

Si effettua un prelievo venoso mediante vacutainer contenente 0,5 ml di sodio citrato al 3,8 %.
Si riempiono due provette da 5 ml ciascuna.
Vengono esclusi dal prelievo quei pazienti che abbiano assunto cortisonici o antistaminici nella settimana precedente l'esame.
Il sangue cosi prelevato viene lasciato sierare naturalmente in frigorifero ad un T compresa tra 4 e 8 ° C.
Il campione deve essere esaminato al massimo entro 48 ore.

Preparazione della sospensione di lettura
Con una pipetta Pasteur metteremo in una prima provetta (A) il plasma surnatante di una delle provette contenenti il campione. In una seconda provetta (B) metteremo il plasma preso vicino all'anello dei bianchi e gran parte dell'anello dei bianchi (quantità tra 0,2-0,3 ml). Ripetiamo l'operazione per una seconda volta.
Avremo quindi nella provetta B una quantità di plasma contenente gran parte dell'anello dei bianchi oscillante indicativamente tra 0,4-0,6 ml. Questa quantità deve poi essere diluita con un equivalente quantità di plasma che abbiamo precedentemente depositato nella provetta A. Abbiamo così la SOSPENSIONE DI LETTURA che oscillerà quantitativamente tra 0,8-1,2 ml per due provette di sangue del paziente.

Nota:
Quando viene prelevato con la pipetta Pasteur Fanello dei bianchi inevitabilmente si pesca anche una certa quantità di globuli rossi e piastrine che facendo parte della sospensione di lettura saranno visti al microscopio. Comunque questi non interferiranno sul risultato del test; globuli rossi piastrine, infatti non devono assolutamente essere considerati per la valutazione del grado di intolleranza.

Metodo della doppia centrifugazione
In casi particolari quando il soggetto ha pochi globuli bianchi o il campione ematico e scarso (come potrebbe capitare a volte con prelievi fatti a bambini) la sospensione di lettura descritta precedentemente può essere ulteriormente centrifugata a bassa velocità (1000-1200 rpm) per ulteriori 10 minuti ottenendo cosi un concentrato di globuli bianchi maggiore, sufficiente per una corretta interpretazione del test.

Lettura del test
La sospensione di lettura va resa omogenea capovolgendo e roteando più volte molto delicatamente la provetta. Si dispongono sui un piatto porta vetrini i vetrini numerati contenenti i reagenti alimentari. Con una pipetta Eppendorf graduata depositeremo una microgoccia, variabile tra 5-6 microlitri sia sui vetrini che contengono i reagenti alimentari sia sul vetrino che non li contiene (controllo negativo).
Dopo circa 15-20 minuti e possibile iniziare la lettura. Si inizia la lettura studiando molto attentamente dapprima il controllo negative e successivamente tutti gli altri vetrini.
(Schema 2).
La lettura si effettua al microscopio a 40 X di ingrandimento contro un vetrino "bianco" non contenente alcun allergene ma soltanto il campione in esame.
Per ogni sostanza la lettura prevede l'osservazione di almeno 5/6 campi. Si può parlare di reazione positiva solo quando si evidenzi un danneggiamento cellulare con una frequenza superiore al 60/70 % dei leucociti all'interno dello stesso campo.
Si distinguono 4 livelli di reazione
TEST NEGATIVO GRADO 0:
Nessuna reazione. La percentuale dei globuli bianchi alterati presente nei cerchietti nel controllo negative contenenti gli alimenti non supera il numero dei globuli bianchi alterati.
TEST POSITIVO GRADO 1 (LIEVE):
Modificazione morfologica modesta a solo carico della parete dei globuli bianchi (deformazione a pera, a bastoncino, a clava ecc.).
TEST POSITIVO GRADO 2 (MEDIA):
Oltre alle modificazioni di forma si evidenzia rigonfiamento cellulare e vacuolizzazione dei globuli bianchi. Non si visualizzano lesioni della membrana cellulare.
TEST POSITIVO GRADO 3 (SEVERA):
Oltre alle alterazioni presenti nei gradi 2 e 3 si assiste alla lesione segmentaria della membrana cellulare.
TEST POSITIVO GRADO 4 (MASSIMA):
Molto rara, esplosione del globulo bianco con apertura pressoché completa della membrana cellulare (disgregazione cellulare).

Risultati
Sono stati testati 124 soggetti, 83 femmine e 41 maschi con una età media di 35 anni. Di questi soggetti 120 sono risultati positivi per almeno un alimento, e 4 negativi, cioè senza alcun alimento reattivo. I soggetti negativi avevano una età compresa tra i 14 e i 22 anni. II maggior numero di alimenti intolleranti si e riscontrato in soggetti sopra i 40 anni. (Tab. 1)
La media di alimenti intolleranti per ciascun paziente e state di 8,64. Le intolleranze più frequenti riscontrate sono state quelle per la carne di maiale (40 casi), per il tuorlo d'uovo (36 casi), il latte di mucca (31 casi), per la carne di tacchino ed il formaggio di mucca (30 casi), per la carne di coniglio ed il lievito (29 casi), per la carne di polio ed il formaggio di pecora (28 casi ). (Grafico 1) Tra gli alimenti meno reattivi troviamo la zucca e l'avena con soli 4 casi, il riso e la soia con 7. (Tab. 2)
Ai 124 soggetti che si sono sottoposti al test, veniva chiesto per quale motive o con quale quesito diagnostico lo eseguivano.
Di questi 20 soggetti non dichiaravano patologie particolari, ma solo sensazioni di affaticamento generate con debolezza muscolare, stanchezza post prandiale, rallentamento digestive, 30 dichiaravano un aumento di peso, secondo loro, ingiustificato sulla base del regime alimentare.
40 soggetti erano stati inviati dal medico con sintomi di colite, 28 con sintomi di gastrite, 6 di prurito sine materia, 9 casi presentavano acne, 14 dermatiti e 1 caso di orticaria e 1 di herpes recidivante. Alcuni soggetti presentavano più di un sintomo contemporaneamente. (Tab. 3)
Nel referto del test veniva riportata una indicazione riguardo a quali alimenti o famiglie di alimenti era necessario evitare e per quanto tempo. (Tab. 4 e Tab. 5) Ai pazienti veniva consigliato di verificare con il medico prescrivente il risultato della astinenza dagli alimenti intolleranti dopo il periodo prescritto ed eventualmente ripetere il test dopo 12 mesi, ossia a complete reinserimento degli alimenti. Tutti i soggetti inviati dal medico si sono presentati al controllo medico, mentre 4 si sono ripresentati dopo 12 mesi per ripetere il test.
Di questi 2 presentavano completa negatività a tutti gli alimenti, 2 (soggetti 3 e 4) avevano mantenuto, o era ricomparsa, un leggero grado di intolleranza ad alcuni alimenti: (Tab. 6)
Nei 30 soggetti dove si era descritto un aumento del peso l'eliminazione degli alimenti intolleranti ha portato tutti i soggetti ad un calo ponderale di circa 3-4 Kg. Osservando la distribuzione di frequenza degli alimenti intolleranti in questi soggetti si osserva una importante incidenza di uova, formaggio e latte. (Tab. 5) I 40 soggetti con sintomi di colite hanno riferito la completa scomparsa della sintomatologia, cosi come i 28 soggetti con la gastrite, i 14 casi di dermatiti, i 6 casi di prurito sine materia. Per i 9 casi di acne si e osservato un netto miglioramento. II caso di orticaria si e risolto, ed il caso di herpes recidivante dichiara una non comparsa da oltre 12 mesi.
Le distribuzioni di frequenza di intolleranza per singolo sintomo/patologia sono riportate nelle tabelle sottostanti.
Nei 20 soggetti con sintomi di affaticamento generale e astenia, osserviamo una dominante della carne di maiale, della pasta di grano e delle uova intolleranti nella maggior parte di questi soggetti.

Conclusioni
Sappiamo che le intolleranze si insediano in un organismo predisposto geneticamente o con uno squilibrio gastroenterico o del sistema immunitario.
È tuttavia verosimile ipotizzare che tanto più si mangia e quanto più a lungo questa iperalimentazione e protratta, tanto più e facile riscontrare la comparsa di intolleranze. Non e un caso che i 4 casi negativi fossero ragazzi giovani, normopeso e dediti ad attività sportiva.
Sulla base dei risultati possiamo osservare come la frequenza delle intolleranze alimentari aumenti con l'età, mentre i sintomi fisici diventano più sfumati man mano che l'organismo "si adatta" allo stress alimentare.
È interessante notare, inoltre la correlazione tra patologie e tipi di alimenti intolleranti.
Osserviamo infatti, ad esempio una alta incidenza delle solanacee, alimenti contenenti alcaloidi, nelle coliti e nelle forme di acne.
Nelle dermatiti sono i latticini a predominare, mentre nei casi di prurito il lievito e quindi tutti gli alimenti lievitati, fermentanti.
Nei casi di aumento di peso sono le uova e i formaggi gli alimenti più frequentemente causa di intolleranza.
L'alta percentuale di risoluzioni delle patologie avuta nei pazienti studiati, solo con la eliminazione degli alimenti intolleranti e sicuramente un dato estremamente significativo.
Per ottenere risultati e stato comunque necessario che i soggetti si astenessero rigorosamente, a seconda del grado di intolleranza, dall'alimento reattivo per il tempo prescritto, eliminando non solo il singolo alimento intollerante, ma anche quelli appartenenti alla stessa famiglia.
Particolare difficoltà ha rivestito la identificazione degli alimenti contenuti nelle preparazioni industriali, se non indicate nelle etichette, ad esempio la presenza di uovo in alcuni vini francesi oppure la soia in molte salse. II test citotossico si e rivelato dunque utile in tutte le patologie con andamento cronico ed accompagnate da sintomi multipli.

I vantaggi del test sono:

• E un test rapido
• I risultati non sono falsati dalla molteplicità delle allergie del paziente
• I risultati sono ripetibili anche con kit commerciali diversi (test eseguiti con due diversi kit hanno dato i medesimi risultati)
• È economico, pensiamo al RAST per 12 alimenti e nel tariffario ASL a Euro 104,30
• È molto sensibile

• La preparazione dei vetrini e lunga e complessa
• La lettura e soggettiva, e fondamentale quindi l'addestramento del tecnico
• Sono necessari campioni freschi

Alla luce di questi dati ci sembra che il test citotossico, se eseguito con allergeni adeguatamente puri e standardizzati industrialmente e da personale accuratamente addestrato possa essere introdotto nella routine di Laboratorio con pari dignità dei classici RAST e IgE, soprattutto come utile supporto per il medico, sia esso dietologo, gastroenterologo, dermatologo nella risoluzione di patologie multiple e croniche.

Scarica il documento completo di tabelle, schemi e grafici.